4、高效果腺体外抗氧化活性试验

（1）对DPPH的液相氧化清除能力

①DPPH溶液的配制自由基

精密称取19.716mgDPPH，用无水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，色谱素得C=0.2mmol／L的法测溶液，于40℃冰箱避光保存。定黑

②样品溶液的肋花制备

分别称取干燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢车菊素、楸提取物氯化矢车菊素、中氯VC适量，化矢含量溶解并且配制成不同质量浓度的车菊样品溶液。分别取不同质量浓度的及抗究样品溶液2mL于10mL比色管中，按参考文献所述方法进行操作，性研在517am处测定吸光度A_空白，高效果腺A_样品，液相氧化A_对照。色谱素按照公式计算黑果腺肋花楸提取物、矢车菊素、氯化矢车菊素、VC对DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率／％=(A_空白一A_样品+A_对照)／A_空白×100

式中，A_空白-蒸馏水代替供试品溶液与DPPH溶液反应后的吸光度值；A_样品-各供试品溶液与DPPH溶液反应后的吸光度值；A_对照-各供试品溶液与无水乙醇反应后的吸光度值。

（2）FRAP法测定总的抗氧化能力

①FRAP工作液的配制

分别配制0.2mol／L醋酸钠缓冲液(pH=3.6)，10mmol／LTPl亿溶液(溶于40mmol／L盐酸)，20mmol／LFeCl₃溶液。将上述三者按体积比10:1:1混合。

②FeSO₄标准曲线的制备

精确称取0.01419FeSO₄，溶解并定容至50mL容量瓶中，即得浓度为lmmol／LFeSO₄溶液。吸取该溶液适量，配制成质量浓度为2.82、8.46、14.10、19.74、25.38、28.20、33.84μg／mL的溶液。取各溶液加入3mLFRAP工作液，混匀后于37℃反应10min，于593nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定还原力标准曲线，列出拟合方程。

③被测物总抗氧化活性测定

分别称取干燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢车菊素、氯化矢车菊素、VC适量，溶解并且配制成不同质量浓度的样品溶液。分别取不同质量浓度的样品溶液3mL于10mL比色管中，按参考文献所述方法进行操作，在593nm处测定吸光度值。

(3)钼酸铵法测定总的抗氧化能力

①钼酸铵反应体系的配制分别称取

2.13g磷酸钠、0.99g钼酸铵、6.67mL硫酸溶于200mL水中，混匀。

②VC标准曲线的制备

精确称取0.02599VC，用蒸馏水溶解并定容至50mL容量瓶中，即得浓度为0.5mg／mL维生素C溶液。吸取该溶液适量，配制成质量浓度为25、50、75、100、200、250tg／mL的溶液。吸取O.5mL不同浓度的溶液，加入到5mL钼酸铵反应体系中，反应试管于95℃水浴90min。反应液充分冷却至室温后，于695am处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定VC抗氧化能力标准曲线，列出拟合方程。

③被测物总抗氧化活性测定分别称取干

燥的黑果腺肋花楸提取物干浸膏、矢车菊素、氯化矢车菊素适量，溶解并且配制成不同质量浓度的样品溶液。分别取不同质量浓度的样品溶液0.5mL加入到5mL钼酸铵反应体系中，按参考文献所述方法进行操作，在695nm处测定吸光度值。被测物的总抗氧化能力以相当于多少浓度的VC来表示。

二、结果与分析

（1）色谱条件的选择

色谱柱为大连依利特ODS₂C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A为甲醇，B为0.2％磷酸水溶液(W)，程序为0～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱温：30℃；进样量：20μL；检测波长为276nm。氯化矢车菊素的保留时间为24.21min，理论塔板数为21917，与相邻峰的分离度为2.28。HPLC色谱图见图1。

2、流动相条件的选择

试验结果表明适宜的流动相为甲醇-O.2％磷酸水溶液(V:V=40:60)，能够将黑果腺肋花楸提取物中的氯化矢车菊素与其他物质分开，保留时间适中，按照氯化矢车菊素峰值计算理论塔板数为21917，与相邻峰的分离度为2.28，故选择在上述流动相条件下进行相关试验。

3、供试品溶液制备方法的优化试验结果

（1）正交试验结果

称取黑果腺肋花楸提取物9份，每份0.5g，放入圆底烧瓶中，按正交试验表进行试验，结果见表2。

正交试验结果表明：供试品溶液制备方法的最优方案为A₃B₃C₂，各因素的影响大小为：水解时间＞水解温度＞溶剂酸浓度，确定供试品溶液制备方法的最优方案为：水解温度为100℃、水解时间为120min、酸浓度为3％盐酸甲醇水溶液。

（2）工艺稳定性验证试验

三次试验结果氯化矢车菊素的峰面积分别为1379.85、1382.57、1380.43，平均值为1380.95，其氯化矢车菊素含量分别为1.8660、1.8527、1.8523mg／g，平均值为1.8570mg／g，RSD为0.78％，结果表明，优选的供试品溶液制备方法工艺比较稳定。

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